已知酶的cds序列和全基因组序列,引物该如何设计？？

nanxinhui 2021-11-03 08:14

开发者_如何学JAVA
既然基因序列已知，就根据ATG。。。。TAG设计引物好了，这样克隆出来可以直接连到表达载体。可以用PRIMER5.0设计，也可以自己手动设计，要注意的就是两个引物退火温度不能相差太大，设计酶切位点的时候要注意克隆出来的基因连到载体上不能移码突变。

检测cds序列可以用的酶切位点，上游引物：保护碱基+酶切位点+起始密码+引物，下游引物：保护碱基+酶切位点+终止密码+引物

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_3310****026093 2021-11-03 08:20

既然已知其CDS序列的，就可以将该序列导入到引物设计软件中，设计好参数即可。
引物设计的软件，有在线的，也有需要下载安装的，例如DNA STAR和primer premier等。然后根据设计原则在软件中选择合适的参数就可以了。
引物设计的原则有：
1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。
2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。
3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太 大。
5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbo开发者_StackOverflowr method)。
6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。
7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。
8. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。
若想了解更多信息，这里有个专栏。http://www.bbioo.com/experiment/12-810-1.html。

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乌鸦高校 2021-11-03 08:29

原核的直接克隆。
真核的先提提RNA来做定量分析，cds区克隆先提rna逆转录，设计cds区引物来pcr然后粗略的测测序有个底开发者_高级运维，然后通过T载体连接到质粒上，最后导入目的菌里面表达，然后提出表达物来验证！大概思路是这样子的，仅供参考。

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